【 原 理 】
DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。
细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。
分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。
当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入
＋
柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。
DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。
大分子DNA的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。
生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷冻保存。
DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。 【 试剂和器材 】 一、试剂
1．0.15mol/L NaCl–0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液：称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 · 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1 000ml。
2．0.15mol/L NaCl–0.1mol/L EDTANa2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1 000ml。
3．5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。
4．氯仿–异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。
5．pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/L Tris–HCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。
6．95％（V/V）乙醇1 000ml。 7．75％（V/V）乙醇1 000ml。
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二、器材
1．组织捣碎机。 2．玻璃匀浆器。 3．冷冻离心机。 三、材料
1．冰、粗盐。 2．鸡肝脏 【 操 作 】
1．本实验以鸡肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验前鸡应饥饿24h以上，以避免糖原的干扰。
2．用烧杯（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。
3．将经过饥饿的鸡剪断颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约1g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。
4．将洗净的组织1-2g剪成碎块。先加入2m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次，使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液至5ml。
5．匀浆液在常温 6 000r/min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀。
6．将沉淀物悬浮于5倍体积的pH8.0，0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2溶液中，搅匀，而后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最终浓度达1%为止（应加多少毫升?），此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做，然后，加入固体NaCl使最终浓度达l mol/L。继续搅拌30～45min，以确保NaCl全部溶解，此时可见溶液由稠变稀薄。
7．将上述混合溶液倒于一个EP管中，加入等体积的氯仿–异戊醇，振荡10min。在室温3 000r/min离心10min（为什么可以在室温操作?），此时可见离心液分为3层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿–异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入EP管中，向水相中，再加入等体积氯仿–异戊醇，振荡，离心，除净蛋白质。
8．最后1次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），放入干燥EP管中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。静置20min，10000r/min 1min，按200μg/ml的浓度（约取1~2ml）溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE缓冲液中。
9. 将提取的DNA进行胶回收纯化（使用试剂盒），纯化后的样品－20℃冰箱冻存备用。 【 实验结果与讨论分析 】
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实验二 目的基因序列的查找与引物设计
【 目的和原理 】
目的在于了解如何在NCBI基因库中查找目的基因序列，并利用软件设计其合适的扩增引物。
两个寡核苷酸引物的设计是PCR扩增的关键，决定着PCR扩增产物的特异性和长度，决定PCR反应的成败。设计引物时以一条DNA单链为基准。在扩增基因片段或cDNA片段时，通常以信息链为基准，5' 端引物与位于待扩增片段5' 端上游的一小段DNA序列相同，引导信息链的合成；3' 端引物与位于待扩增片段3' 端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成，PCR反应扩增的就是这一对引物之间的双链DNA片段。寡聚核苷酸引物采用化学合成的方法制备，必须经过聚丙烯酿胺凝胶电泳或反向高压液相层析纯化，才可用于PCR反应。引物设计的基本要求包括以下几点：
1．引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会影响PCR的特异性，引物过长会提高退火温度，并使延伸温度超过DNA聚合酶的最适温度影响产物的生成。
2．引物中的碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。G+C含量在引物碱基中一般占45%~55%。设计引物时要考虑3' 端和5' 端引物具有相似的Tm值，按引物的碱基组成计算Tm值的公式为：Tm=4（G+C）+2（A+T）。
3．引物自身不应存在互补序列，以避免折叠成发夹结构。
4．两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3\"端的互补重叠。
5．引物3' 端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3' 端最佳碱基选择是G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。
6．引物与模板结合时，引物的5' 端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。因此，引物的5' 端可以进行修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。
现有许多引物辅助设计的计算机软件，如Oligo 4.1、Primer 5.0等用于指导PCR引物的辅助设计。
【 操 作 】
一、在NCBI基因库中查找目的基因序列—human alpha-Lactalbumin gene mRNA
登陆NCBI主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，在Search选项中选择Nucleotide，输入要查找的目的基因名称：human alpha-Lactalbumin gene mRNA，在查找到网页中找到对应序列，按照解释，选择可用的片段大小。
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human alpha-Lactalbumin gene mRNA序列
1 atttcaggtt cttgggggta gccaaaatga ggttctttgt ccctctgttc ctggtgggca 61 tcctgttccc tgccatcctg gccaagcaat tcacaaaatg tgagctgtcc cagctgctga 121 aagacataga tggttatgga ggcatcgctt tgcctgaatt gatctgtacc atgtttcaca 181 ccagtggtta tgacacacaa gccatagttg aaaacaatga aagcacggaa tatggactct 241 tccagatcag taataagctt tggtgcaaga gcagccaggt ccctcagtca aggaacatct 301 gtgacatctc ctgtgacaag ttcctggatg atgacattac tgatgacata atgtgtgcca 361 agaagatcct ggatattaaa ggaattgact actggttggc ccataaagcc ctctgcactg 421 agaagctgga acagtggctt tgtgagaagt tgtgagtgtc tgctgtcctt ggcacccctg 481 cccactccac actcctggaa tacctcttcc ctaatgccac ctcagtttgt ttctttctgt 541 tcccccaaag cttatctgtc tctgagcctt gggccctgta gtgacatcac cgaattcttg 601 aagactattt tccagggatg cctgagtggt gcactgagct ctagaccctt actcagtgcc 661 ttcgatggca ctttcactac agcacagatt tcacctctgt cttgaataaa ggtcccactt 721 tgaagtcaaa aaaaaaaaaa aa 说明：CDS 27..455；
translation=\"MRFFVPLFLVGILFPAILAKQFTKCELSQLLKDIDGYGGIALPE LICTMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWCKSSQVPQSRNICDISCDKFLDDDITDDIMCAKKILDIKGIDYWLAHKALCTEKLEQWLCEKL\"
二、引物设计
按照基因序列说明扩增完整的human alpha-Lactalbumin gene mRNA序列，引物设计必须包括编码区CDS 27..455，利用Primer5.0软件进行设计，具体设计原则按原理中几条要求考虑，实验有其他要求时，需要按要求必须含盖或加上另外的部分必需序列，包括酶切位点等。
【 注意事项 】
1．寻找目的基因时，要仔细考虑自己的实验要求，选择合适的序列部分。
2．引物设计要求按引物设计的基本要求，耐心和细心进行尤其需要按要求必须含盖或加上另外的部分必需序列时。
【 实验结果与讨论分析 】
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实验三 DNA的PCR扩增实验（多聚酶链反应）
【 原 理 】
通常的DNA扩增法是分子克隆法。首先要构建含有目的基因的载体，然后将其转入细胞后进行扩增，再用同位素探针进行筛选。这种方法，需经过DNA内切、连接、转化和培养等有关过程，操作复杂，一般需数周时间才能完成，而PCR基因扩增法只需几小时，就可用电泳法检出0.1微克基因组DNA中仅含数个拷贝的摸板序列，所以，这种基因扩增法又称无细胞分子克隆法。
PCR基因扩增是一种特定区段DNA的复制，其复制方式是以半保留形式进行的。PCR扩增法的DNA复制，必须有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物及四种dNTP。如图16-1所示，要扩增模板DNA中A-B区间的DNA片段，首先要设计二条寡核苷酸引物A’和B’，PCR扩增DNA的特异性是由这二条人工合成的引物质决定的。A和B片段的DNA序列是已知的，这是PCR扩增的必要条件，但A-B中间的序列未必清楚。A段和B段序列的长度一般为15-20个碱基，据此可用DNA合成仪人工合成与A、B对应互补的二个引物A’和B’，PCR扩增系统中的模板DNA经过高温变性分解二条单链后，又进行降低温（55-37℃），引物退火，与互补的模板DNA结合，形成局部的双链，这是DNA复制的固定起点，即延伸的固定起点。如图16-1所示，A和A’结合，B和B’相结合，退火的时间为1～2分钟。
PCR扩增过程中，链的延伸具有方向性，以引物为固定起点，延伸才能进行。目前使用的DNA多聚酶，合成DNA的方向都是从5’端到3’端。当温度升至中温（60–72℃）时，在多聚酶的作用下，四种dNTP会迅速以旧链为模板合成新链，其合成方向，若以A’和B’引物而言，都是从5’端到3’端的方向进行。PCR扩增片段的长度范围，从数百个至2kb个碱基。在此扩增中，真核细胞和原核细胞没有明显的差别，其扩增的长度由引物来限定。模板DNA经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环过程。每循环一次，模板DNA的拷贝数加倍，第一次循环由一条模板双链DNA变成二条；第二次循环，则变成4条；第三次循环，就变成8条„„，以几何级数扩增下去，一般扩增循环是30-35次，最后形成特定的DNA片段。PCR扩增DNA特定区段，是由人工合成的二条引物决定的，这是PCR扩增的关键。
【 试剂和器材 】 一、试剂
1．Taq DNA多聚酶
在PCR 100μl反应体系中，Taq DNA多聚酶用量为1–2.5单位．由于DNA的不同和引物的不同，以及其他条件上的差别，则多聚酶的使用量亦有差异。如果酶的浓度偏高，会出现非特异性产物堆积；如酶的浓度偏低，则合成产物的量少。因此，常常根据电泳的结果决定酶的最佳用量。
2．三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） dNTP 用 NaOH 贮存（pH7.0），最初的贮存液可稀释到10mmol/L，分装后存放于－20℃冰箱内。使dNTP工作储存液为lmmol/L，其使用浓度为20–200μmol/L之间，这四种的dNTP必须以当量浓度配合，以减少错配误差。在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少在非靶位置上启动和延伸时核苷酸错误掺人。决定最低dNTP浓度是根据靶序列的长度和组成。例如，在100μ1的反应体系中，四种dNTP的浓度使用20μmol/L，基本能满足合成2.6μgDNA或10pmol的400bp序列。使用低dNTP浓度，能够高灵敏扩增ras基因点突变的等位基因。
3．引物
引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L之间。引物的浓度偏高，会引起错配和非特异性产
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物的堆积，同时能增加生成引物二聚体的几率。非特异性产物和引物的二聚体，竞争使用酶，引物及dNTP，结果是特异性产物的量降低。
典型引物包括15–30个核苷酸，组成中含有45–55%的G+C，计算的Tm值与使用的引物对应一致。为此，可使用拇指规则计算A或T、G或C的温度校正系数。应用上：希望Tm值在55–80℃ 之间。首先要避免两条引物的3’末端互补，以生成引物的二聚体；应避免在G+C富集序列上的错配；还应避免引物内的回文序列。这些都是设计引物应遵循的原则。
4．镁离子
选择合适的镁离子浓度是很重要的。其浓度可影响到引物的退火，模板和PCR中间产物的链解离温度，产物的特异性，引物二聚体的生成及酶的活性等。在PCR反应系统中，镁离子浓度0.5–2.5mmol/L之间，超过了dNTP浓度。如果浓液中存在EDTA，或在引物贮备液中有其他螯合物或DNA模板，会干扰镁离子的浓度。因此，应适当调整镁离子的用量。
5．其他反应组成物 （1）Tris–HCl
在PCR中使用10–50mmol/LTris–HCl（pH8.3–8.8，20℃ ）缓冲液，双极化离子缓冲液。
（2）KCl
KCl 浓度为50mmol/L，它能促使引物退火。NaCl 的浓度为50mmol/L，而KCl浓度大于50mmol/L时，将会抑制Taq DNA多聚酶的活性。
（3）牛血清蛋白，明胶或非离子型生物去污剂，能帮助稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，有些操作中也可不加蛋白，亦能获得良好的结果。
二、器材 1．PCR仪 2．EP管 【 操 作 】
一、 PCR的基本操作
在微量离心管内，加PCR用缓冲液、四种脱氧单核苷酸（dNTP）溶液，耐热性多聚酶、两个合成DNA的引物、微量的模板DNA及适量的水。然后将离心管放入PCR基因扩增仪内进行扩增。将上述溶液加热，使模板DNA互补退火，形成部分的双链；再将溶液反应温度升至中温，在耐热性多聚酶的作用下，以dNTP为原料，以引物为复制的起点，模板DNA的一条双链，在解链和退火之后延伸成为两条双链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段，这三次改变温度为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次或30次以上的循环，最终使基因放大数百万倍。将扩增产物进行电泳。经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下，用肉眼能见到扩增的特异区段的DNA带。
其规范操作由下列三部分组成： 1．25μl反应体系的PCR
在0.5ml的离心管内，加入如下试剂：
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DNA模板 1μL 引物 两种：上游引物 1μL 下游引物 1μL dNTP 四种 1μL Buffer 2.5μL Taq DNA多聚酶 0.2μL 蒸馏水 18.3μL 总体积 25μ1
2．PCR三个阶段的温度控制
变性温度 95℃ 15秒 引物退火 5℃ 30秒 新链延伸 72℃ 1.5分
3．循环25次～35次
开始时，模板DNA变性时间要适当延长，最后一次循环的延伸时间要保持5分钟．反应终止要立即冷却到4℃或加入10mmol/L EDTA以终止反应。
二、 PCR反应的基本条件 1．引物的退火
引物退火温度和所需时间的长短取决于反应体系中的基本组成、扩增引物的长度和浓度。实际使用的退火温度要比扩增引物的Tm值低5℃。因为TaqDNA多聚酶的活性温度范围很宽，引物延伸将在低温下获得。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L），退火仅需要数秒即可完成。严格规定退火温度，特别是前几个循环中，会增加扩增的特异性。
2．引物的延伸
延伸时间的长短取决于模板序列的长度、浓度及延伸温度的高低，引物延伸在72℃条件下进行，因为72℃时核苷酸补位的速度为35～100个核苷酸/秒，其速度取决于缓冲液的组成、pH值、盐的浓度和DNA模板的性质。
3．变性时间和温度
模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，都会导致酶的活性损失。所以，掌握好变性时间和温度是十分重要的。
4．循环次数
当其他参数选定之后，循环次数主要取决于模板DNA的浓度。循环反应的次数过多，则非特异性产物的量亦增多；但循环次数太少，则特异性扩增产物的产率低。在标准模板细胞浓度下，循环反应的参考的界线如下表。
【 注意事项 】
1．污染。PCR能够从极少的样品，例如一根毛发，甚至从一个细胞中，分离出其中的DNA作为模板，对其特定序列进行大量地扩增。如果样品污染了，特别是扩增系统中混入了以前扩增的靶序列，将会与样品一样大量的扩增，使试验结果难以区别。
2．设对照试验。即除不加入模板DNA之外，试验的全过程与本实验与完全相同的条件步同步进行。扩增之后，对照试验不出现扩增电泳带，说明PCR操作过程中没有受到污染。如果对照试验出现扩增电泳带，则说明PCR操作过程中已被污染。因此，设对照试验是必要的。
3．隔离操作。PCR扩增仪应与PCR操作场所分开。如果通过对照试验证实样品易被污染时，则PCR操作应在生物反应橱中进行。操作中应戴未污染薄胶手套，所用的试剂及操作器具应尽可能放在专用柜内。
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4．试剂的配制。分装与保存都应在无PCR产物的环境中进行。引物的合成和纯化也要在无PCR产物的环境中进行。试剂分装的量及其浓度应与操作的用量、浓度基本一致，避免再次分装造成污染。
5．使用PCR专用的加样器。PCR专用的微量加样器不可兼作另用。EP管和Tip头也应用新品。移液时应慢吸慢吹出，不能过快。
6．应细心操作。离心管开盖或上盖时都要非常小心，谨防溶液雾化或外溅。加液的离心管开盖之前应先离心一下。尽可能减少样品操作次数。扩增产物电泳带要用新刀片切割，并一定用保鲜纸（薄膜塑料）事先铺在紫外线透射仪表面上，以避免污染。 【 实验结果与讨论分析 】
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实验四 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
【 原 理 】
所谓“凝胶”是指在一定形状的制胶容器中所形成的包含电解质的多孔支持介质。当核酸分子位于凝胶的某个部位，在电场中核酸分子将向正极移动。DNA分子由于两条链相互配对形成双螺旋结构，随着DNA链长度的增加，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，这样，不同长度的DNA片段表现出不同的迁移率，因而可依据DNA分子的大小将它们分开。通过染色和与标准相对分子质量的DNA的对照来进行检测。琼脂糖凝胶电泳的分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，但在分离范围上优于聚丙烯酰胺凝胶电泳，并有便于制备和操作的优点。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2～50kb范围内的DNA片段。而聚丙烯酰胺凝胶电泳一般适用于分离小片段的DNA（5～500 bp），在这个范围内相差仅一个碱基的 DNA分子都能获得较满意的分离效果，如在DNA序列测定时常用含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。
用琼脂糖凝胶分离DNA在分子生物学研究中是经常使用的方法，这主要是因为琼脂糖凝胶具有操作方便、制备容易快速、凝胶机械性能好、分离DNA片段范围广等特点。DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子或片段泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外（电荷效应），还与DNA分子的大小和空间构象有关（分子筛效应）。DNA的相对分子质量越大，其电泳的迁移率就越小；超螺旋的DNA与同一相对分子质量的开环或线状DNA的电泳迁移率也明显不同。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅0.5～1/1g，超薄平板型琼脂糖凝胶所需样品DNA量可以更低。凝胶浓度与被分离DNA样品的相对分子质量成反比关系，一般常用的凝胶浓度为1%～2%。在电泳的形式上常用平板型电泳，因为平板型电泳可将多个样品和标准相对分子质量DNA放在同一块胶上进行电泳，使各样品在相同的条件下进行电泳，便于相互间的比较。
电泳时，用溴酚蓝示踪DNA样品在凝胶中所处的大致位置，但每种DNA样品所处的确切位置需要用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 对DNA分子进行染色才能确定。溴化乙啶可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与DNA分子形成一种荧光络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡，但小分子DNA浸泡时间过长容易引起扩散，故可根据被分离DNA分子的大小选择不同的染色方法。溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
【 试剂和器材 】 一、试剂 1．TBE×l0缓冲溶液（0.89mol/L Tris–0.89 mol/L硼酸–0.025 mol/L EDTA缓冲溶液）：取108g Tris，55g硼酸和9.3g EDTA（EDTANa2 · 2H20）溶于水，定容至1 000mL，pH=8.3。作为电泳缓冲溶液时应稀释10倍。
2．溴酚蓝–甘油指示剂：0.05g溴酚蓝溶于100ml 50%甘油中。 3．50%甘油
4．0.5mg/L溴化乙啶染色液：取5mg溴化乙啶，用少量去离子水溶解，定溶至10ml。取1 ml稀释至1 000ml。
5．琼脂糖
6．样品DNA：2.5mg DNA溶于100ml TBE缓冲溶液中。 7．标准相对分子质量DNA。
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二、器材
1．电泳槽及胶床 2．电泳仪 3．乳胶管 4．微量进样器 【 操 作 】 （一）制胶
1．取琼脂糖1 g，加pH＝8.3的TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成1%的琼脂糖胶液。此胶液可立即使用，或置于冰箱中保存，临用前在沸水浴中熔化即可。
2．采用垂直柱型电泳时，取制胶用的玻璃管（10cm×0.6cm）若干，将玻璃管的一端用一小段乳胶管套住，并塞以玻璃珠封住管底，向管底滴加2滴50%的甘油。
3．将已熔化的琼脂糖胶液加入玻璃管中，待琼脂糖凝固后，取下乳胶套管，将凝胶管侧放，让凝胶从玻管中滑出，放平，用刀片将凝胶一端切平，留下约9cm长的凝胶柱，并用去离子水和电极缓冲溶液冲洗以去除甘油。将玻璃管的一端用尼龙纱网套住，以防管中凝胶滑出（注意平端向上）。将凝胶管接到电泳槽上，上、下槽加入TBE电泳缓冲溶液。
（二）加样
取样品DNA 40μL，加10μL溴酚蓝－甘油指示剂，混匀，用微量注射器上样。 （三）电泳
电泳时控制电流强度在2～5mA/管范围内，当溴酚蓝指示剂距管底1cm左右时断电，结束电泳。
（四）染色
1．电泳完毕后，将凝胶管从电泳槽中取出，一手按住上管口，另一手摘去尼龙纱网套，然后慢慢松开上管口，将凝胶放入试管中。
2．向试管中加入0.5mg/L溴化乙啶染色液，浸泡染色20～30分钟，染色液可以重复使用。将染色后的凝胶放在紫外灯下观察，有DNA的位置会呈现出橙黄色的荧光，可在紫外灯下进行拍照记录。也可以将溴化乙啶放入胶中（终质量浓度为0.5mg/L），电泳后可在紫外灯下直接观察结果。
3．注意：溴化乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。
【 实验结果 】
1．天然双链DNA电泳所采用的缓冲溶液有：Tris–醋酸–EDTA（TAE）、Tris–硼酸–EDTA（TBE）或Tris–磷酸–EDTA（TPE）等。TAE缓冲容量较TBE和TPE低，长时间电泳易导致其缓冲能力丧失。在电泳分辨率上三者差不多，只是超螺旋DNA在TAE缓冲体系中分辨率更好一些。
2．电泳中，溴酚蓝和500bp大小的DNA一起移动，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指征。但在不同浓度的凝胶中，溴酚蓝相对应的DNA片段的大小是不同的。
3．如电泳后DNA条带不是尖锐清晰而是形状模糊，可能是由于以下几种原因：①DNA加样量太大；②电压太高；③加样孔破裂；④凝胶中有气泡。
【 注意事项 】
1．Amberlite XAD–16或活性炭可用于净化被EB（溴乙啶）污染的物体表面。
2．溴化乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行如下处理：
方法I：（1）每100ml溶液中加非离子型多聚吸附剂Amberlite XAD-16.29g； （2）室温下放置12小时，不时摇动；
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（3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物丢弃。 方法Ⅱ：（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭； （2）室温条件下放置1小时，不时摇动； （3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物丢弃。
溴化乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。
【 实验结果与讨论分析 】
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实验五 核酸含量测定——紫外分光光度法
【 目的和原理 】
1．学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。 2．熟悉紫外分光光度计的基本原理与使用。
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700~7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022~0.024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
【 试剂和器材 】 一、试剂
1．钼酸铵-过氯酸沉淀剂：如配制200ml，可在193ml蒸馏水中加入7ml高氯酸和0.5g钼酸氨。
2．样品RNA或DNA干粉。 3．5%~6%氨水 二、器材
1．容量瓶（50毫升） 2．离心管 3．离心机
4．紫外分光光度计 【 操 作 】
1．用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量水稀释。然后用5%~6%氨水调至pH7加蒸馏水定容到50ml。于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算核酸浓度：
RNA浓度（μg/ml）=（A260×N）/（0.024×L） DNA浓度（μg/ml）=（A260×N）/（0.020×L）
式中，A260——260nm波长处光吸收读数；L——比色皿的厚度，1cm；N——稀释倍数
2．如果待测的核酸样品中含有大分子核酸，需加钼酸氨-高氯酸沉淀剂，沉淀除去，测定上清液260nm波长处A值作为对照。
取两支离心管，向第一支管内加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水，向第二支管内加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂（以除去大分子核酸）作为对照。混匀，在冰浴中放置，30min后离心（3000rpm），从第一、第二管中分别吸取0.5ml上清液，用蒸馏水定容到50ml。用光程为lcm的石英比色杯于260nm波长处测其光吸收值(Al和A2)。计算核酸浓度：
RNA或DNA的浓度（μg/ml）=（A1-A2）×N/（0.024或0.020×L） 核酸%=（1ml待测液中测得的核酸维克数/1ml待测液中制品的维克数）×100
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【 实验结果讨论 】
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值>1.8；当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 【 思考题 】
1．若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰? 2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正? 【 实验结果与讨论分析 】
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实验六 RNA分离和提纯实验
【 目的和原理 】
目的在于了解和掌握RNA制备的方法、操作步骤、注意事项和技术关键。
RNA的分离提纯目前多用苯酚法。组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠存在下，RNA与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离目的。
【 试剂和器材 】
1．250 g/L SDS：称取十二烷基硫酸钠25 g，溶于50％乙醇中至100 ml，室温存放。 酚：分装于棕色瓶中。
2．0.05 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）：0.5 mol/L 醋酸钠35 ml，0.2 mol/L 醋酸15 ml ,加蒸馏水稀释至1000 ml，混匀后测pH应为5.0。
3．2 mol/L 醋酸钠：取无水醋酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解后配成100 ml。
4．0.1%DEPC水：在试剂瓶中，DEPC与无菌去离子水按0.1%（V/V）比例混合，37℃放置2小时，121℃高压灭菌30分钟。
（备注：配制以上试剂时均用0.1%DEPC水处理的蒸馏水。） 【 操 作 】 1. 准备工作
玻璃器皿用0.1mol/L NaOH浸泡过夜，自来水反复冲洗后，蒸馏水冲洗两遍，180℃烘烤4小时。Tip头和EP管等塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌备用。双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0.1ml DEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30min使DEPC失活。电泳槽用3%双氧水浸泡20～30min，再用0.1%的DEPC水冲洗。为免未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5%SDS处理。 2. RNA的提取—Trizol法提取总RNA
（1）组织匀浆 从液氮中迅速取出组织样品，放在已灭菌烘干的陶瓷研钵中，倒入少量
液氮，将其研成白色细末；按每100mg组织加1ml Trizol的比例加入Trizol试剂，用枪头迅速搅匀后，转到1.5ml的EP管中。
（2）离心4℃，12 000r/min离心10min，将上清液移到新的EP管中（若上清顶层有一层
脂肪，应去除）。 （3）相分离 按初始使用的Trizol量，每1ml Trizol加0.2ml氯仿于上清液中，盖紧管盖，
在15～30℃下温育5min，彻底去除核蛋白复合物；4℃，不超过12 000rpm 离心15min，取上层水相。
（4）沉淀RNA 将上清液转到新的EP管中，按初始使用的Trizol量，每1ml Trizol加
入0.5ml异丙醇，混合使RNA沉淀；15～30℃温育10min；4℃，不超过12 000rpm 离心10min。
（5）RNA沉淀的洗涤 去上清，按初始使用的Trizol量，每1ml Trizol加1ml 75%乙醇
于沉淀中，吹打混匀后，4℃，7 500r/min离心5min。
（6）RNA的重溶与保存 去上清，使RNA沉淀风干或自然干燥（勿让沉淀完全干燥）；
用不含RNase的灭菌水（如用100µl DEPC水）溶解RNA，置于-70℃ 保存。另外，在75%乙醇洗沉淀后，取一部分放在-20℃贮存，用时再离心重溶。 3. RNA的浓度和质量检测
（1）RNA的浓度测定 从RNA原液中取10µl，用DEPC水稀释至400µl，测定样品的
A260和A280值。根据A260和A280比值，估测RNA浓度和提取质量（一般A260和A280比值在1.8～2.0之间，可以满足实验要求）。RNA浓度计算公式为：
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原液浓度（ng/µl）=A260×稀释倍数×40 【 注意事项 】
1．在RNA的提取操作中，有条件应在0~4℃进行。
2．RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液，甚至灰尘中都有RNA酶的存在，因而RNA酶的的降解作用是RNA提取中致命的问题，在提取RNA的全过程必须在清洁无尘的环境中进行，操作人员要使用一次性的手套拿取物品，穿工作服，戴口罩。
3．酚有腐蚀性，操作时应小心，若沾洒在皮肤上立即用水或用70%酒精棉球擦洗。 【 实验结果与讨论分析 】
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实验七 RNA甲醛变性凝胶电泳
【 原理 】
甲醛是一种常用的RNA变性剂。在进行甲醛电泳分析时，必须先配制含有甲醛的胶体，RNA也必须先以甲醛进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应该在通风橱里小心操作；进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS。此外，含有甲醛的胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA占细胞RNA总量的80~85%，染色后呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large与small rRNAs（真核生物为28S与18S，原核生物为23S与16S）；散布于small rRNA附近，呈淡淡smear的就是mRNAs，这是因为mRNAs存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5SrRNA及tRNA等则在胶体下方也以特定色带呈现。
【 试剂和器材 】
1．配制1.2%甲醛变性电泳凝胶：其中琼脂糖占1.2%，10×MOPS占10%，37%甲醛占3%。
例如：配制30ml甲醛变性电泳凝胶：称取0.36g琼脂糖溶于26.1ml DEPC处理的水中→冷却至60℃→加3ml 10×MOPS和0.9ml 37%甲醛，加入少量EB。
2．电泳液为1×MOPS。 【 操 作 】 1．样品处理：（25μl）
RNA（多达10-15μg）：2μl 10×MOPS：2.5μl 37%甲醛：4.4μl
甲酰胺：12.5μl DEPC-H2O：3.6μl
2．混匀后离心→55℃水浴15min→迅速冷却→加5μl加样缓冲液。如此处理是为打开RNA的二级结构
3．电泳：66伏电压，1小时。 【 注意事项 】
1．甲醛胶脆、易碎。
2．甲醛蒸汽有毒，应在通风橱中配制。 【 实验结果与讨论分析 】
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实验八 质粒DNA的微量制备（碱裂解法）
【 原 理 】
在EDTA存在下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿–异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程产生的泡沫，并能使离心后水层，变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。
【 试剂和器材 】 一、试剂 1．LB液体培养液：胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L，用NaOH调节至pH7.5。。 2．TEG缓冲液（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖，4mg/ml溶菌酶）：称取0.3g Tris加入0.1mol/ＬHCI溶液14.6ml，先配制成pH8.0Tris–HCl缓冲液100ml，再加入0.37g EDTA-Na2· 2H20和0.99g葡萄糖，临用前加入400mg溶菌酶。
3．碱裂解液（0.2mol／L NaOH、1％SDS）：称取0.8g NaOH和1g SDS定容至100ml。 4．乙酸钾溶液（pH4.8）：取60ml 5mol／L KAc（或称取29.4g KAc）加入11.5ml冰乙酸和28.5ml蒸馏水。
5．1mol／L pH8.0 Tris–HCl缓冲液：Tris 121.14g/L，用盐酸调至pH8.0。 6．氯仿：异戊醇=24:1（Ｖ/Ｖ），等体积的酚和氯仿/异戊醇溶液混合。放置后，上层若出现水相，可吸出弃去，有机相置棕色瓶内低温保存。
7．TE缓冲液（10mmol／L，pH8.0 Tris-HCl，l mmol/L EDTA）：称取0.12g Tris，加适量蒸馏水溶解，用1mol／L盐酸调至pH8.0并定容至100ml，加入0.037ｇEDTANa2 · 2H20。
8．抗菌素（如pBR322质粒加入氨苄青霉素50μg／ml培养基，四环素12.5μg／ml培养基）
二、器材
1．水平振荡器 2．高压灭菌器 3．接种环 4．灭菌试管
5．Eppendorf离心管 6．离心机 7．滤纸 三、材料
1．携带pBR322质粒的E.coli HBl01菌株。 【 操 作 】
1．培养细菌扩增质粒
根据质粒的抗性于3ml LB液体培养基内加入适当的抗菌素（如pBR322质粒加入氨苄青霉素50μg／ml培养基，四环素12.5μg／ml培养基）。
用接种环挑取1个单菌落或吸取少量菌液于含上述双抗LB液体培养基的灭过菌管中，37℃，振荡培养12h左右。
2．收集菌体和裂解细菌
取1.5ml培养液置Eppendorf离心管内，离心，5000r/min，5min，弃去上清，保留菌体
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沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，收集菌体。
将菌体沉淀悬浮于预冷的150μl TEG缓冲液内，剧烈振荡、混匀，室温放置10min。 加入200μl新鲜配制的碱裂解液，加盖，颠倒数次，轻轻混匀，冰上放置5min。 3．分离纯化质粒DNA
加入150μl冰冷却的乙酸钾溶液，加盖后温和颠倒数次混匀，冰浴放置15min，使沉淀完全。
4℃下离心，12000r/min，5min。乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量SDS–Na＋转化为溶解度很低的SDS–K＋一起沉淀下来。离心后，上清液若仍混浊，应混匀后再冷至0℃，重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。
加入等体积的酚/氯仿饱和溶液，反复振荡，离心，12000r/min，2min，小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管内。
上述溶液加入2倍体积的预冷无水乙醇，混合摇匀，于冰浴上放置10min。4℃下离心， 300r／min，5min，弃去上清液。并将Eppendorf管倒置在干滤纸上，空干管壁粘附的溶液。
加入70％冷乙醇lml，洗涤沉淀物，离心，弃去上清液，尽可能除净管壁上的液珠，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。
将DNA沉淀溶于20μlTE缓冲液（临用前加入20μg／ml RNaseA），置-20℃保存。
【 实验结果与讨论分析 】
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实验九 质粒的酶切与电泳鉴定实验
【 原 理 】通过质粒DNA浓度测定、质粒DNA限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA片段的试验，掌握用分光光度计测定DNA含量、用限制性内切酶酶解质粒DNA以及用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定质粒DNA的方法。
在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA序列，在一定的条件下切断双链DNA。选择合适的限制性内切酶对质粒DNA 酶切，酶切产生粘性末端。
【 试剂和器材 】 一、试剂 酶切缓冲液
EcoRⅠ酶解缓冲液（10×）：1 mol/L pH 7.5 Tris·HCI，0.5 mol/L NaCI，0.1 mol/ L MgCI2。 HindⅢ 酶解缓冲液（10×）：0.1 mol/L pH 7.4 Tris·HCI，1 mol/L NaCI，0.07 mol/L MgCI2。 TBE缓冲液（10×）：称取Tris 108 g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 40 ml，用H2O定溶到1000 ml，高压灭菌作为10×贮液，稀释10倍后作为工作液使用。
TE缓冲液：10 mmol/L Tris·HCI，1 mmol/L EDTA pH 8.0，其中含有 20 µg/ml Rnase 1ul。 上样液及其他试剂 上样液（6×）：0.25 % 溴酚蓝，质量体积比为40%的蔗糖水溶液。 溴化乙啶染色液（10 mg/ml）：在20 ml H2O中溶解0.2 g溴化乙啶，混匀后于4℃避光保存。
氯仿，异丙醇，70 % 乙醇。 二、仪器
微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。 三、材料
含有质粒pBluescript或pGEM-3Zf的大肠杆菌DH5α、DL2000 Marker、EcoRⅠ、HindⅢ 限制性内切酶、琼脂糖等。
【 操 作 】
1. 用分光光度计测定质粒DNA的浓度
（1）用蒸馏水将待测DNA样品做1:200倍的稀释。
（2）用蒸馏水作为空白，在波长为260 nm、280 nm调节分光光度计读数至零。 （3）加入DNA稀释液于以上2个波长处读取OD值。 （4）记录OD值，通过计算确定DNA浓度，公式如下：
DNA浓度（µg/µl）=OD260×稀释后总体积/稀释量×50/1000 2. 质粒DNA的酶切
将上一实验提纯并溶于20 µl TE的质粒DNA用于双酶切，按下表分别加入所需试剂。
质粒 酶切缓冲液 酶液
16µl 2µl 各1µl
加样后小心混匀，置于37℃水浴或金属浴中酶切1小时（有时可以长一点至，数小时或过夜），65℃水浴5min或向管中加入Loading buffer 4 µl来结束酶切反应，取5µl样品进行电泳分析。
3. 琼脂糖凝胶的制备
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（1）琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8 g琼脂糖，置于三角瓶或小烧杯中，加入100 ml TBE工作液，置于微波炉加热直至琼脂糖完全溶解（注意不要让液体沸腾出瓶外），加入1µlEB染色液，混匀。
（2）胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒置在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。 4. 加样
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面，本实验样品孔容量约10 µL左右。 5. 电泳
加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。建议在80 V~100 V的电压或20 mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5 V/cm。电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以低温为好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5% 时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳。 6. 观察和拍照
DNA存在处显示出桔红色的荧光条带。一般紫外光激发30 s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼睛或有机玻璃防护面罩，避免眼睛受到强紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳带谱。
【 实验结果讨论 】
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实验十 实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆cp4基因含量
【 目的和原理 】
实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）又称荧光定量PCR，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线，按照PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，加入相应的内对照，对待测样品中的对未知模板进行定量分析的方法。
根据转基因大豆中含有的内参基因Lectin 基因和外源基因CP4-EPSPS基因设计特异性引物进行实时荧光定量PCR检测，以确定转基因大豆中是否含有外源基因CP4-EPSPS基因并确定其含量。
表1 荧光定量PCR引物序列及扩增片段大小 引物/探针名
称
Lec -1 Lec -2 CP4 -1 CP4 -2
序列（5′→3′）
GCCCTCTACTCCACCCCCATCC GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG GGCGACGCCTCGCTCACAA CGCAAGGTAACGGGAAGACGGT
扩增基因
片段大小（bp） 118
Lectin CP4-EPSP
S
111
【 试剂和器材 】
1．SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒，(Code DRR041A) 大连宝生物工程有限公司。2．特异引物，上海英俊生物公司。
3．实时荧光定量PCR仪（美国ABI，ABI Prism® 7300型）。 【 操 作 】
1．对照设置：阴性对照以非转基因大豆DNA为模板；阳性对照用转CP4基因大豆材料中提取的DNA为模板；空白对照以去离子水代替DNA模板。
2．配置SYBR GreenⅠ法反应体系：每个20μL PCR反应体系中包括SYBR Premix Ex Taq（2×）10μL，0. 4μL ROX Referance Dye（50×），1μL DNA模板溶液，上下游引物各0.4μmol/L及7.2 ul灭菌的去离子水，所有参加反应模板每个试样平行3个反应；
3．将配好的反应体系用移液器加入到96孔板中；
4．压膜：在加好样品的96孔板上用荧光定量PCR反应专用膜封好； 5．将96孔板放入荧光定量PCR仪中。 6．进行实时荧光定量PCR反应：
荧光定量PCR反应按以下程序运行：第一阶段95℃10s；第二阶段95℃5s、60℃31 s，共40个循环，在第二阶段的60°C复性和延伸时收集荧光信号。然后将SYBR Green Ⅰ的扩增产物从60℃缓慢而均匀地以0.1℃/ s的速率升温到95℃，得到扩增曲线的熔解曲线。
7．数据处理：实验数据用SDS软件（Sequence Detector System，美国ABI公司）分析。 利用△Ct值法进行相对定量分析，根据目的基因和内参基因扩增Ct值算出每个样品的△Ct（Ct 目的基因－Ct内参基因），利用公式2-△Ct（Ct 目的基因－Ct内参基因）计算出每个样品的转基因含量。
【 实验结果讨论 】 1．阈值设定
荧光定量PCR反应结束后，设置荧光信号阈值，阈值设定原则根据仪器噪声情况进行
21
调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．质量控制
在内参基因Lectin 基因扩增时，空白荧光曲线平直，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线，或者空白对照荧光值低于阴性对照荧光值的15%；在外源基因CP4-EPSPS基因扩增时，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直，阳性对照出现典型的扩增曲线，或者空白对照和阴性对照荧光值低于阳性对照荧光值的15%，表明反应体系工作正常。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。
3．结果判定
在PCR反应体系正常工作的前提下：
（1）待测样品基因检测Ct值大于或等于40，则判定样品未检出该基因；
（2）待测样品基因出现典型的扩增曲线，且检测Ct值小于或等于阳性对照的Ct值，则判定样品检出该基因，利用△Ct值法进行相对定量分析，根据目的基因和内参基因扩增Ct值算出每个样品的△Ct（Ct 目的基因－Ct内参基因），利用公式2-△Ct（Ct 目的基因－Ct内参基因）计算出每个样品的转基因含量。
（3）待测样品基因出现典型的扩增曲线，检测Ct值大于阳性对照的Ct值但小于40，应进行重复实验，如重复实验的外源基因CP4-EPSPS基因出现典型的扩增曲线，且检测Ct值小于40，则判定样品检出该基因，利用△Ct值法进行相对定量分析，根据目的基因和内参基因扩增Ct值算出每个样品的△Ct（Ct 目的基因－Ct内参基因），利用公式2-△Ct（Ct 目的基因－Ct内参基因）计算出每个样品的转基因含量。
【 思考题 】
1．利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量PCR反应为什幺要进行熔解曲线分析? 2．利用实时荧光定量PCR进行定量与普通PCR的比较有何优点？ 3．SYBR GreenⅠ法和TaqMan 探针有何区别？
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分子生物学实验作业题（每题300字）：
1．DNA制备的基本原理和操作步骤，植物、动物和微生物DNA制备方法有何差异？
2．如何通过生物信息学手段确定基因组中编码序列、非编码序列及其功能信息？
3．有哪些常用的PCR技术，各有何应用？
4．怎样确定DNA的纯度以及如何通过定量PCR确定及计算拷贝数？
5．有哪些影响所分离RNA质量的因素？
6．举例说明质粒DNA的结构特征，影响质粒制备有哪些因素？ 7．根据已知一个基因的部分序列，如何设计实验获得该基因的全序列？
8．设计实验确定一个已知序列的基因的功能。 9．举例说明基因芯片技术的应用。
10．各举一个例子说明基因芯片技术及蛋白质双向电泳技术的应用。
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