柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性分析

江苏农业学报（刀■至仙_/.〇/如r.Sd.) ,2017,33(3) :2〜8

http: //\\v\\v\\v.jsiiyxb.com

郭长明，袁橙，张步彩，等.柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性分析[J].江苏农业学报，2017,33(3):2-8.

floi:10.3969/j.iwn.1000-4440.2017.03.023

柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性

分析

郭长明U2，袁橙U2，张步彩2，朱善元2，严若峰\\徐立新\\ 宋小凯\\李祥瑞1

(1.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095; 2.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室， 江苏泰州225300)

RT-PCR技术克隆获得了烯醇化酶基因

(GenBank Accession No. GU169333)。烯醇化酶基因开放阅读框长1 338 bp，编码445个氣基酸。应用DNAstai'软 件对氨基酸序列的亲水区域和疏水区域的分布、抗原指数及T细胞基序进行分析，结果显示该蛋白质亲水性较强， 抗原指数高，含较多T细胞表位。同时构建了烯醇化酶原核表达重组质粒pET-28a(+)-£WO。用IPTG对重组质粒 pET-28a(+)-£WO进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白大小约为5.17X104,主要存在于裂解上清 中。Western blotting结果显示该重组蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗体识别，表明该蛋白质具有较好的免

疫原性。

关键词：柔嫩艾美耳球虫；烯醇化酶；克隆；表达；免疫原性中图分类号：

摘要：从纯化的柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中提取总RNA，应用

S858.312.72+3 文献标识码：A

文章编号：

1000-4440(2017)03-02-07

Cloning， expression and antigenic analysis of enolase gene of Eimeria tenella

GUOXU

Chang-ming1，2，

YUAN

Cheng1，2,

ZHANG

Bu-cai2，

ZHU

Shan-yuan2，

YAN

Ruo-feng1，

Li-xin1，SONG Xiao-kai1，LI Xiang-rui1

(1.College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China； 2. Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College/ Jiang­su Provincial Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Key Laboratory， Taizhou 225300，China)

Abstract ： Enolase gene of Eimeria tenella (GenBank Accession No. GU169333) ( EtENO) was amplified from total

RNA extracted from E. tenella second-generation merozoites by^ RT-PCR. The sequence of EtENO contains an open reading

frame of 1 338 bp and encodes 445 amino acid. DNAstar software analysis showed that EtENO has high antigenic index，lots

of hydrophilicity plots and T cell motif. The recombinantplasmid pET-28a ( + ) -ENO was constructed and 收稿日期：2016-12-27

transformed into Escherichia coli BL2, ( DE3) for expres­基金项目：国家自然科学基金国际（地区）合作与交流项目（NSFC-

sion. SDS-PAGE indicated that the fusion protein (5.17x PSF，中巴）（31661143017);国家自然科学基金面上项目

104) was expressed in the supernatant after induction by (31372428、31672545);江苏高校优势学科建设工程资助

IPTG. Western blotting revealed that the protein was spe­项目（PAPD)

作者简介:郭长明（ 1984-)，男，山东临朐人，博士，讲师，主要从事预 cifically recognized by polyclonal antibodies against E.

防兽医学（寄生虫分子免疫和病原微生物方向）研究。tenella，suggesting that the fusion protein is antigenic.(E-mail) gcmscience@ 126.com Key words： Eimeria tenella； enolase； cloning；

通讯作者：李祥瑞，（E-mail)lixiangrui@ njau.edu.cnexpression ； immunogenicity

郭长明等:柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性分析3

鸡球虫病是严重危害养禽业的寄生虫病，每年 造成巨大的经济损失。生产实践表明，加强饲养管 理可以减少鸡舍内、外球虫卵囊的数量，但仅仅依靠 此项措施不能有效地控制鸡球虫病的发生。因此, 抗球虫药物的使用是当前养鸡业中球虫病的主要防 治手段[13]。由于药物治疗花费较大和耐药虫株的 出现，通过疫苗免疫来预防鸡球虫病已成为一项重 要的手段[4]。现阶段用于鸡球虫病防治的疫苗主 要有球虫活疫苗和亚单位疫苗。近年来，开发了

Immuncox、 Co(:(:iva(:和 EimerivacPlus 等活疫苗[5]。

但活卵囊疫苗具有以下缺点：（1)生产成本相对较 高；（2)强毒疫苗的毒性较高；（3)减毒株疫苗存在 毒力返强的可能；（4)某些虫株抗原变异，疫苗效果 存在地理株的差异。已有研究结果表明，亚单位疫 苗预防鸡球虫病可获得良好的效果[611]，成为球虫 疫苗研究的热点。

迄今为止，已报道的具有一定免疫原性球虫基 因的来源主要包括柔嫩艾美耳球虫（teraeZ-

Za，)、堆型艾美耳球虫（£. acermZi'raa)、毒害艾美耳

球虫（£. necafri'*)和巨型艾美耳球虫(E. maxima

)。

其中£. toraeZZa的抗原基因有54W、S07、imC

-67/、

GX

3262、Et7b2、EtlAI、Etr〇p

/5 和 EtS3a

[2—14];而 E

.

acermZiraa 的抗原基因有 3-7E、9S4、EaZA、M47、

EAMZp

?0-40和M

A

76等[|5—|6]。这些基因编码的抗

原蛋白都具有良好的免疫原性，为鸡球虫亚单位疫 苗的研究提供了重要的基础。

LaW

)6等[17]从裂殖体c

DNA

文库中克隆了柔嫩

艾美耳球虫烯醇化酶(EfEWO)基因，发现EfEWO

基

因在子孢子阶段有表达，在缺氧的裂殖生殖过程中

表达量增加。在激活的条件下，及EWO

存在于子孢

子内部和细胞外，也存在于子孢子和裂殖体的细胞

核中。以上结果提示及E

WO

不仅在糖酵解过程中

发挥作用，而且可能参与了球虫人侵机体的过程，或 可作为鸡球虫亚单位疫苗的候选蛋白。但及EWO

的免疫原性尚未见研究报道。

本研究利用RT-PCR的方法，以纯化的E. torael-

Za第二代裂殖子为材料，克隆及EWO

基因的开放阅

读框（Open reading frame，ORF

)，用 DNAstar 生物学

软件对其序列进行了抗原性分析，同时构建原核表

达载体pET28a( +) -E

WO

，在大肠杆菌中表达EtENO

融合蛋白，并对其抗原性进行研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1球虫卵囊E.toraeZZa卵囊由本实验室（南京 农业大学兽医寄生虫分子与免疫实验室）保存。1.1.2 细菌和载体 宿主菌E. c〇Zi DH5a、BL21 (DE3)、表达载体pET28a (+)由本实验室保存，

pMD18-T vector克隆载体购自大连宝生物（TaKa-

Ra

)工程有限公司。

1.1.3 试剂

Trizol试

剂为Promega公司产品，

DEPC

为Amresco公司产品，反转录酶AMV、Oligo

(dT ) 18、r7^酶、dNTP、D

NA

分子量标准物

DL

2000、T4 DNALigase、性内切酶 Eco RI

、限

制性内切酶&ZI

、水饱和酚和琼脂糖胶回收试剂盒

均为大连宝生物（TaKaRa)工程有限公司产品，His 标签蛋白纯化柱（His Trap™ FF crude )购自

GE

Healthcare公司，蛋白

质Marker购自Thermo公司，

鸡抗E. toraeZZa多克隆抗体由本实验室保存，兔抗鸡 二抗购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1

E

. toraeZZa第二代裂殖子的分离和纯化用

E

. toraeZZa孢子化卵囊以每羽1X105个经口接种14

日龄无球虫感染的三黄鸡，120 h后扑杀取盲肠，参 照文献[18]的方法分离和纯化第二代裂殖子。1.2.2 总R

NA

的提取及c

DNA

的合成取适量上

述纯化好的E. teraeZZa第二代裂殖子置于D

EPC

处

理过的玻璃勻浆器中，加人1 ml Trizol试剂，研磨10

min

，采用一步法[19]提取总R

NA

。以

Oligo(dT)18

为引物进行反转录合成cDNA

:总RNA

1. 0 pg、Oligo

(dT)18 1.0 pl混勻后75丈变性5 min，立即置冰上 冷却,再加人 dNTP (10 mmol/L) 2. 0 pl、5xRT buff­

er 4. 0 ^l、Mg〇2 ( 25 m

mo^L

) 2. 0 ^l、RNasin 1. 0

pl、AMV (5 U/^l) 1.0 pl，加 DEPC 处理过的

ddH2O

至20 pl，混勻，42丈水浴反应1 h，然后95丈

灭活5 min。1.2.3

EtEWO

基因的RT-P

CR

扩增根据已发表的

EtEWO

基因序列（GenBank 登录号:AAK

38886.1)，应

用PrimerPremier5.0软件合成1对克隆引物。上游引 物(P1)添加 Eco RI酶切位点:5。GAATTCATGGTG-

GCCATAGTCGAGGTC

-3，;下游引物（P2)添加 &ZI酶

切位点:5，- GTCGACCTAGTTGGAGGGGTTTCGGA-3，。 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。以cDNA

4江苏农业学报 2017年第33卷第3期

为模板，用酶扩增份基因，PCR

条件为： 94丈预变性3

丈变性45 s，70丈到50丈梯度退火45 s，每个循环降落1丈，72丈延伸120 s，20 个循环;94丈变性45 s，50丈退火45 s，72丈延伸 120 s，15个循环;72丈延伸10 min。反应结束后， 取扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳并观察结果。 紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶，用胶回收 试剂盒纯化目的片段备用。

1.2.4 份基因的鉴定将回收的份EWO PCR

产物与p

MD

18-T载体连接并其转化cW

DH

5a

感受态细胞，按常规方法培养，提取质粒并用

&〇 RI和Sa/ I酶切鉴定和PCR扩增鉴定。将3 个鉴定正确的克隆送上海英俊生物技术有限公司进 行测序。将测序结果用DNAstar软件进行编辑，并 与

GenBank

的份基因序列进行

BLAST

分析。

1.2.5份基因的原核表达用及〇 R I、Sa/ I 分别双酶切P

MD

18-T-E

WO

和

pET

28a ( +)质粒，用 胶回收试剂盒回收份五層目的基因和pET28a ( +) 大片段，连接构建pET28a( +)-E

WO

重组质粒，转化

BL

21(DE3)感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上选

择性培养后，按方法1.2.4筛选、鉴定阳性克隆。挑 取阳性菌落，37丈振荡培养过夜，将菌液按1 : 100 的比例接种于含60 pg/ml卡那霉素的L

B

培养基

中，37丈培养至0乃_ = 0.4〜0.6,加入IPTG(终浓 度1 mmol/ml)进行诱导表达，分别收集0 min、15

min

、30 min、45 min、60 min、75 min 的菌液各 1 ml 进

行

SDS-PAGE

分析。将菌体重悬于P

BS

溶液，在冰

浴中超声破碎，12 000 r/min离心5 min，分别收集上 清和沉淀，用

SDS-PAGE

分析表达蛋白在菌体中的

分布。重组蛋白的纯化参照HiS标签蛋白纯化柱说 明书进行。

1.2.6 Western blot分析镍柱纯化的表达产物和 转化有pET28a (+)的BL21(DE3)菌体蛋白对照经

SDS-PAGE

后，以

Bio-RAD

系统电转移至P

VDF

膜

上，经牛血清白蛋白封闭后，依次加入柔嫩艾美耳球 虫多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡gIG 抗体，最后在联苯胺（DA

B

)溶液中显色，观察结果。2

结果

2.1 EtENO 基因 RT-PCR 扩增

利用合成的特异引物，以E. tene//a第二代裂殖

子

cDNA

为模板，进行RT-P

CR

。PCR

产物的1%。琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约1 500 b

p

处有一特异

性目的条带，大小与预期1 338 bp—致（图1)。

M

1

2 000 bp1 000 bp 750 bp 500 bp250 bp100 bp

M:DL2000分子质量标准;1:RT-PCR产物。

图1 PCR扩增基因

Fig.l Amplification of EtENO gene by PCR

2.2

EtENO基因的酶切鉴定及PCR鉴定

PCR

产物连接p

MD18-T克隆载体获得p

MD

18-

T-EA

/0重组质粒，Era R

I

和Sa/ I双酶切结果显示，在

约1 338 bp处有一目的条带，与预期大小一致（图2)。 以重组质粒p

MD

18-T-EW0为模板，用克隆引物进行

PCR

鉴定，结果与酶切鉴定结果一致（图3)。

M

1

2

2 000 bp

1 000 bp 750 bp 500 bp250 bp 100 bp

M:DL2000 分子质量标准；l:Ec〇 R I/Sa/ I 双酶切；2:pMD18-T-

ENO质粒。图2重组质粒pMD18-T-ENO的双酶切鉴定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-ENO by

EcoR VSal I digestion2.3

EtENO基因序列测定及分析

将酶切及P

CR

鉴定均正确的重组质粒进行测

序，结果显示克隆片段含一个长1 338 bp

的开放阅 读框（0R

F

)，与Labb6等[17]报道的份E

NO

基因（登

录号:AF353515)的同源性为99%c;编码445个氨基 酸，理论分子量为4.80x 104。该序列已提交Gen-

Rank

， 登录号为 G

U

169333。

郭长明等:柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性分析5

2.4

EtENO蛋白抗原性分析

应用DNAstar软件对E

tENO

氨基酸序列的亲

水区域（Hydrophilicity plot)的分布、抗原指数（Anti­

2 000 bp

1 000 bp 750 bp 500 bp250 bp 100 bp

genic index) 及 T 细胞表位 （T cell motif) 进行分析

(图4)。份基因编码的蛋白质片段有大量的亲 水区域，并且连续分布;氨基酸区域抗原指数较高且 连续分布，有8个区域抗原指数达到3以上，其中在 12〜22位、301〜313位氨基酸抗原指数最高，达到 3. 4;EtENO蛋白质共有19个

T

细胞表位，连续分

NO

18-T-£WO。

图3重组质粒pMD18-T-£WO的PCR鉴定 Fig.3 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-ENO by

PCR

M:DL2000 分子质量标准；l:PMD

布。从以上结果可以看出，EtE一步研究E基因构建D

tENONA

蛋白质片段亲水

性较强，抗原指数高，含较多T细胞表位，这些为进

的生物学功能提供了参考，利用该 疫苗可能会有较好的保护效果。

0 40 A ■ ■ ■

80 120 160 200

III

240280320360400440

氨基酸序列位置■ a 区a 区

域（Gamier-Robson法） 域（Chou-Fasman法）

々区域（Gamier-Robson法） 夕区域（Chou-Fasman法）

WH~KH ■转角区域（Gamier-Robson法）

■1 番1 ■ I H! ■转角区域（Chou-Fasman法）

+■+〇 卷曲区域（Gamier-Robson法）

亲水性图（Kyte-Doolittle法）

■ ■ ■

a两亲性区域（Eisenberg法） _ ■々两亲性区域（Eisenberg法）

B 柔性区域（Karplus Schulz法）

•

抗原指数（Jameson-Wolf法）

〇表面概率图（Emini法）

G T细胞表位（Rothbard-Taylor法）

图4 EtENO蛋白质结构及抗原性分析

Fig.4 Analysis of structure and antigenic index of EtENO protein

2.5份基因原核表达质粒的构建

用

pET

Eco R

minNONO

的诱导表达菌。SDS-PAGE电泳结果表明，EtE­

I、Sa/ I对提取的重组表达质粒

WO

融合表达蛋白大小在 5.17X104 左右 （其中 EtE­ 为 4.80x 104 ， pET28a 载体为 3.7x 103) ， 诱导后

28a(+)-E进行酶切鉴定，切出1 338 b

p

左右

的片段，与预计大小相符（图5)。2.6重组表达质粒中的表达

鉴定为阳性的重组单菌落用IPTG诱导表达， 分别收集0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75

45 min表达量最高（图6)。超声波破碎后的沉淀与 上清的SDS-PAGE分析结果表明，大部分重组蛋白 以可溶性蛋白质形式表达（图7)。2.7重组

pET28a( +)-爾0在大肠杆菌

EtENO蛋白质的纯化

细菌裂解上清经过蛋白质纯化柱纯化后，进行

6

江苏农业学报 2017年第33卷第3期

M

1 2

2 000 bp1 000 bp

750 bp 500 bp250 bp 100 bp

M:DL2000分子质量标准;1: R I和&ZI双酶切;2:重组质粒

pET28a(+)-^0。

图5重组质粒pET28a( +) 双酶切鉴定

Fig.5 Analysis of the recombinant plasmids pET28a ( +) -ENO

digested with restriction endonucleases

9.46.62xl〇xl〇〇4

44.5〇xl〇43.5〇xl〇42.6〇xl〇42.0〇xl〇41.44xl〇4

M

:蛋白质分子量标准;1〜6: pET28a ( +) -£WO分别诱导0 min、 15 min、30 min、45 min、60 min、75 min 后的菌液；7:空载体 pET28a (+) IPTG诱导前菌液;8:空载体pET28a (+) IPTG诱导 75 min后的菌液。图6 pET28a( + ) -ENO表达产物的SDS-PAGE分析 Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression products of pET28a

(+) -ENO

9.46.62xl〇xl〇〇444.5〇xl〇43.5〇xl〇42.6〇xl〇42.0〇xl〇41.44xl〇4

M

:蛋白质分子量标准；1:诱导表达菌液裂解沉淀;2:诱导表达

菌液裂解上清;3:诱导表达45 min的菌液。图7重组EtENO蛋白质可溶性的SDS-PAGE分析

Fig.7 SDS-PAGE analysis of solubility of recombinant EtENO

protein

SDS-PAGE

分析，结果显示得到了纯化的重组蛋白

(图8)。

M

1

9.40x1 6.62x1 〇〇44

4.50x1 〇43.5〇xl04 2.6〇xl 〇4

2.00x1 〇4

1.44xl〇4

M

:蛋白质分子量标准;1:纯化后的蛋白质。

图8纯化重组EtENO蛋白质的SDS-PAGE电泳检测

Fig.8 SDS-PAGE of recombinant EtENO protein after purifi­

cation

2.8 Western blot分析重组EtENO蛋白质的抗原

性

纯化的重组蛋白经S

DS-PAGE

后电转移至

PVDF

膜上进行蛋白质印迹分析（图9)。从图9中 可见在分子量5.17X104处有一条明显的蛋白质印

迹带，说明该重组蛋白具有反应原性和球虫抗原性。

M

1 2

7-OOxlO4

5.50X104 4.0〇xl〇4 3.5〇xl〇4 2.50X1041.5〇xl04

M

:蛋白质分子量标准;1:纯化后的蛋白；2:转化有pET28a ( +) 的BL21( DE3)菌体蛋白对照。图9 Western blot分析重组EtENO蛋白质的抗原性 Fig.9 Antigenicity analysis of recombinant EtENO protein by

Western blot

3讨论

烯醇化酶是糖酵解途径中催化2-磷酸甘油酸 与磷酸烯醇式丙酮酸之间转化的酶，是一种比较保 守的蛋白质。很多研究者发现烯醇化酶定位于细

郭长明等:柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性分析7

菌、真菌、原虫[則、蠕虫[21]的表面。它是一种多功 能蛋白质，能与细胞骨架蛋白质和多聚核苷酸结合， 具有热休克蛋白的功能[22 24],还是纤溶酶原及层粘 连蛋白的受体[25]，在感染和免疫中可作为抗体作用 的靶分子[26],在寄生虫侵袭宿主组织过程中发挥作 用™。

LaW

)6等[|7]首次对EtENO特性进行了研究，发

现在子孢子阶段就能检测到及基因的表达，并 且发现在缺氧的第一代裂殖生殖过程中,£出^0基 因的表达量增加了。在激活的条件下，烯醇化酶不 仅存在于子孢子内部，并且一部分分泌到细胞外。 另外，烯醇化酶也存在于子孢子和裂殖体的细胞核

中。De等[27]通过实验证明EtENO作为免疫原性蛋 白存在于子孢子阶段。

Liu

等[28]研究发现EtENO

贯穿于柔嫩艾美耳球虫生活史的始终。这些研究结 果提示烯醇化酶不仅在糖酵解过程中发挥作用，还 可能参与寄生虫人侵机体的过程，并且可能有调节 基因表达的功能,可作为开发新型疫苗的候选蛋白。

本研究利用国外已报道的£出^〇基因序列设 计一对特异性引物，利用RT-PCR方法从 第二代裂殖子表面成功克隆出£出#0基因ORF

，通

过测序得知该基因ORF

长1 338 bP，编码445个氨

基酸。用DNAstar生物学软件进行分析，发现本研

究所克隆的及^#0基因ORF

与国外公布的及EWO

基因O

RF

核苷酸同源性为99%，仅有1个碱基发生

突变，说明这个基因在不同地理株之间有很强的保 守性，推测突变原因可能是由于不同地理株发生变 异造成的。本研究采用基因工程技术获得大量纯度 较高的重组E

tENO

蛋白，抗原性分析结果显示，该

蛋白反应原性和球虫抗原性较好，是一个在鸡球虫 亚单位疫苗和基因工程疫苗研发中具有研究价值的 球虫抗原蛋白。这为进一步研究烯醇化 酶的生物学功能以及免疫保护性奠定了基础。参考文献：[1]

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(责任编辑：张震林)