巴斯德毕赤酵母表达系统的巴斯德毕赤酵母的载体
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发布时间：2022-04-22 01:08
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时间：2024-03-28 09:51
是整合型载体。常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。 与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似，构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下：
(1)经典遗传学操作方法（如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析）；
(2)分子遗传学方法（如DNA转化、基因置换等。）为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。多拷贝表达菌株的获得方式有两种。一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。
经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子，其产物的表达水平不同。即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。转化子的表达情况也不近相同。因此，为了获得高产量的表达菌株，需要对大量的转化子进行筛选。小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。 包括：适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通气量；添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但此时外源基因的表达被完全抑制。而当甘油缺失或被完全消耗时，甲醇被添加到培养液中，诱导产生外源蛋白。此阶段菌群生长迟缓，但产物表达旺盛。
